Alkuperäinen teksti: Siwei Zou
In English: Transcription Factor Footprinting with Fiber-Seq
Transkriptiotekijät ovat keskeisessä roolissa geenien ilmentymisen säätelyssä sitoutumalla DNA:n tiettyihin alueisiin. Tämä sitoutuminen jättää genomiin “jalanjälkiä” – suojattuja alueita, jotka antavat meille vihjeitä siitä, mitä geenejä transkriptiotekijät säätelevät. Yksi kehittyneimmistä menetelmistä näiden vuorovaikutusten tutkimiseen on Fiber-Seq, joka mahdollistaa transkriptiotekijöiden jalanjälkien kartoittamisen korkealla resoluutiolla ja pitkillä DNA-jaksoilla.
Kromatiinin saavutettavuus: DNA-pakkautumisen kaksi puolta
Ennen kuin syvennymme Fiber-Seq:n toimintaan, on tärkeää ymmärtää kromatiinin rakenne – materiaali, josta kromosomit koostuvat. Ihmisen DNA on uskomattoman pitkä, noin 2 metriä solua kohden, mutta silti se mahtuu solun tumaan, joka on vain 5-10 mikrometriä halkaisijaltaan. Tämä on mahdollista, koska DNA kiertyy histoni-proteiinien ympärille muodostaen helminauhamaisia rakenteita, joita kutsutaan nukleosomeiksi. Nämä nukleosomit pakkautuvat tiiviisti yhteen muodostaen kromatiinia, joka voi olla joko avointa ja saavutettavaa tai tiukasti sulkeutunutta ja saavuttamatonta.
Transkriptiotekijöiden sitoutuminen DNA:han riippuu siitä, kuinka löysästi tai tiukasti kromatiini on pakattu. Avoimessa kromatiinissa DNA on enemmän esillä, mikä mahdollistaa transkriptiotekijöiden sitoutumisen säätelyelementteihin ja geenien ilmentymisen kontrolloinnin. Sitä vastoin suljetussa kromatiinissa DNA on tiukasti kiertynyt, mikä vaikeuttaa transkriptiotekijöiden ja muiden säätelyproteiinien vuorovaikutusta DNA:n kanssa. Tätä avoimen ja suljetun kromatiinin välistä tasapainoa kutsutaan kromatiinin saavutettavuudeksi, joka on kriittinen tekijä geenien säätelyssä.
Fiber-seq: Proteiinien sitoutumisen kartoitus korkealla resoluutiolla
Perinteiset tekniikat kromatiinin saavutettavuuden tutkimiseen, kuten ChIP-Seq tai ATAC-Seq, pilkkovat DNA:n lyhyiksi fragmenteiksi ennen analysointia. Vaikka nämä menetelmät voivat tarjota arvokasta tietoa, niillä usein menetetään laajempi, jatkuva kuva kromatiinin rakenteesta ja transkriptiotekijöiden sitoutumisesta.
Fiber-Seq kukistaa tämän rajoituksen käyttämällä ainutlaatuista lähestymistapaa. Menetelmässä kromatiinin saavutettavat alueet leimataan metyylitransferaasientsyymillä, joka lisää kemiallisia merkkejä DNA:han. Nämä merkit paljastavat, mitkä genomin alueet ovat avoinna transkriptiotekijöiden sitoutumiselle. Merkitsemisen jälkeen leimat luetaan käyttäen pitkien lukemien DNA sekvensointiteknologioita kuten PacBio tai Nanopore, jotka voivat lukea paljon suurempia DNA-jaksoja kerralla verrattuna perinteisiin menetelmiin.
Transkriptiotekijöiden jalanjäljet: geenisäätelyn paljastaminen
Yksi Fiber-Seq:n arvokkaimmista sovelluksista on transkriptiotekijöiden jalanjälkien kartoittaminen – niiden genomisten alueiden, joihin nämä proteiinit sitoutuvat säädelläkseen geenien ilmentymistä. Kun transkriptiotekijät sitoutuvat DNA:han, ne suojaavat kyseistä aluetta metyylitransferaasin merkinnältä, jättäen jälkeensä “jalanjäljen”. Vertailemalla metylaatiosignaalin muotoa alueilla, joissa on ja ei ole transkriptiotekijöiden sitoutumista, tutkijat voivat tarkasti kartoittaa nämä jalanjäljet.
Esimerkiksi laboratoriossamme tutkimme kromatiinin saavutettavuutta paksusuolen adenokarsinooman solulinjassa GP5d käyttäen Fiber-Seq menetelmää, ja pystyimme kartoittamaan transkriptiotekijä ELF2:n sitoutumisen EIF3K-geenin promoottoriin. Solujen tumiin lisätty ELF2 loi jalanjäljen vähentämällä metylaatiota tietyissä DNA-motiiveissa (GGAA**GGAA).
Tämä paljasti tarkat kohdat, joissa ELF2 vuorovaikuttaa genomin kanssa, tarjoten arvokasta tietoa siitä, miten geenien ilmentymistä kontrolloidaan näissä soluissa. Lisäksi, minkä tahansa, jopa tuntemattoman TF:n jalanjäljet voidaan paljastaa vertaamalla metyylitransferaasilla käsiteltyjen solujen metylaatiosignaalia korkealla suolapitoisuudella (jopa 0,5 M) esikäsiteltyjen solujen metylaatiosignaaliin; suolakäsittelyn pitäisi huuhtoa sitoutuneet proteiinit pois. Tässä genomisten sekvensointidatojen vertailussa jalanjälkien pitäisi ilmestyä.
Fiber-seq:n tulevaisuus geenisäätelyn tutkimuksessa
Fiber-Seq edustaa merkittävää edistysaskelta kyvyssämme tutkia transkriptiotekijöiden sitoutumista ja kromatiinin rakennetta. Toisin kuin aiemmat menetelmät, jotka keskittyvät pirstaleiseen dataan, Fiber-Seq määrittää kromatiinin saavutettavuuden ja proteiinien sitoutumisen laajemmassa kontekstissa, tarjoten kattavamman näkemyksen geenien säätelystä.
Teknologian jatkuvasti kehittyessä Fiber-Seq:stä tulee todennäköisesti entistä tehokkaampi ja laajemmin käytetty. Sen kyky tarjota korkearesoluutioisia, pitkiä lukemia kromatiinin rakenteesta ja transkriptiotekijöiden sitoutumisesta tekee siitä lupaavan työkalun tutkimukseen syövän, kehitysbiologian ja epigenetiikan alueilla.
Kiinnostaako syöpätutkimus? Haluatko kuulla lisää Kasvaingenetiikan tutkimuksen huippuyksiköstä?
Seuraa blogia, löydät meidät myös Instagramista @tumorgenetics ja Twitter/X:stä @CoEinTG
Tumor Genetics Blog 