Kirjoittanut: Aurora Taira

Mikä täydellinen päivä piirakan leipomiseen! Kaiva esiin reseptikirjasi ja katso sivua, johon olet laittanut kirjanmerkin. Ehkäpä muutkin suosikkisi ovat saaneet oman kirjanmerkkinsä, kun puolestaan sivu homejuustolla maustetusta sienikeitosta on jätetty tyystin huomiotta…Tai ehkäpä se on jopa merkitty punaisella varoitusmerkillä! 

Kehosi jokainen solu käyttää itse asiassa samaa reseptikirjaa valmistaessaan tarvitsemiaan proteiineja, jotka tekevät soluista sellaisia kuin niiden täytyykin olla. Tämä ei välttämättä kuulosta uskottavalta, sillä ovathan solut silmässäsi ja isovarpaassasi aika lailla erilaisia. Juju piilee siinä, että solut ovat laittaneet kirjanmerkkejä saman kirjan eri sivuille; vaikka joka solussa onkin identtinen genomi, ei joka solussa valmisteta joka ikistä mahdollista proteiinia.

Me geneetikot kutsumme tällaisia “kirjanmerkkejä” epigeneettiseksi säätelyksi. DNA:n metylaatio on lienee kaikkein tutkituin epigeneettisen säätelyn mekanismeista ja liittyy usein geeniekspression vaimentamiseen. Epigeneettisten tekijöiden säätely on ehdottoman tärkeää solujen normaalille erilaistumiselle, kasvulle ja toiminnalle. 

Miten käy, kun reseptikirjaa ei tulkita oikein? – Esimerkkinä lymfooma-alttius suomalaisessa perheessä

Solussa reseptikirjan (eli tässä tapauksessa genomin) lukeminen voi mennä pieleen monella tapaa. Jos solussa on mutaatioita, voi itse reseptikirja olla rikki. Solu voi tässä tapauksessa valmistaa toimimattomia proteiineja. Kirjanmerkit väärillä sivuilla voivat johtaa epänormaaliin geenisäätelyyn. Usein nämä muutokset altistavat solut haitalliselle kehitykselle ja siten syövän synnylle.

Löysimme hiljattain suomalaisen perheen, jossa useammalla henkilöllä oli diagnosoitu lymfooma. Koska kaikki potilaat olivat samasta perheestä niin arvelimme, että nämä ihmiset ovat luultavasti perineet jonkin hematologisille syöville altistavan mutaation. Mutaatiotutkimusten jälkeen havaitsimme, että osa perheenjäsenistä kantoi perinnöllistä heterotsygoottista mutaatiota geenissä nimeltään TET2.

Kertomus TET2:sta

TET2 on tärkeä DNA:n demetylaation säätelijä hematopoieettisissa soluissa ja hematologisia sairauksia potevilla henkilöillä on usein somaattisia mutaatioita tässä geenissä. Tarkastelemamme perheen TET2-mutaation kantajilla on tästä entsyymistä vain yksi toiminnallinen kopio ja tästä johtuen havaitsimme heidän genomissaan ylimääräistä metylaatiota eli hypermetylaatiota. Epigeneettisessä säätelyssä on tapahtunut virhe; Koska toiminnallisen TET2 entsyymin määrä on laskenut, ei demetylaatio eli metylaation poisto tapahdu normaalisti ja metylaatiota kertyy vääriin paikkoihin genomissa. Toisin sanoen mutaatio tärkeässä epigeneettisessä säätelygeenissä aiheuttaa virheitä genomin kirjanmerkkeihin ja altistaa mutaation kantajat kohonneelle riskille sairastua lymfoomaan.

Perheeseen kuului iäkkäämpien lymfoomadiagnoosin saaneiden mutaation kantajien lisäksi nuorempia aikuisia, joilla ei oltu todettu lymfoomaa mutta joiden genomissa havaittiin ylimääräistä hypermetylaatiota. Voisimmeko tehdä jotain tälle hypermetylaatiolle ja siten mahdollisesti pienentää näiden ihmisten riskiä sairastua lymfoomaan?

Kirjanmerkit kuntoon C-vitamiinilla

Tutkimustuloksia ei voi soveltaa käytäntöön eikä uusia hoitomuotoja kehittää ilman perustutkimusta. Aikaisemmat tutkimukset hiirillä ja solulinjoilla olivat löytäneet kiehtovan piirteen tutkimastamme geenistä: C-vitamiini tehostaa TET2:n toimintaa. Tästä innostuimme kysymään, voisiko sama toimia myös ihmisillä. Osa tutkimamme lymfooma-alttiusperheen jäsenistä osallistui tutkimukseen, jossa osallistujat söivät päivittäin yhden gramman C-vitamiinia vuoden ajan. Keräsimme verinäytteitä ennen tutkimuksen aloittamista, puolen vuoden kohdalla ja vuoden kuluttua C-vitamiinikuurin aloittamisesta ja analysoimme kokeen osallistujilta genominlaajuiset metylaatio- ja geeniekspressiotasot.

Toden totta, kokeemme näytti toimivan! Havaitsimme, että C-vitamiini tehosti demetylaatiota ja vähensi hypermetyloitujen positioiden osuutta ns. enhancer-alueilla (geenisäätelyyn liittyviä alueita). Ennen C-vitamiinitutkimuksen alkua TET2 mutaatiostatus nosti metylaatiotasoja tärkeiden hematopoieettisten transkriptiofaktoreiden (esimerkiksi TBX21 ja SPI1) sitoutumispaikoilla, mutta ei enää 12 kuukauden kuluttua päivittäisen C-vitamiinilisän ottamisen jälkeen. Mutaation kantajien ja mutaatiota kantamattomien perheenjäsenten väliset geeniekspressioerot vähenivät C-vitamiinitutkimuksen päätyttyä.

Tulosten tulkinta – helppo nakki?

Tulosten tulkinta ei ollut helppoa, sillä demetylaation säätely ei ole yhtä yksinkertaista kuin jatko-opiskelija voisi toivoa sen olevan. Demetylaatio voi tapahtua joko passiivisesti solunjakautumisen yhteydessä tai aktiivisesti TET2:n aiheuttaman oksidaatioreaktion avulla. TET2:n aiheuttaman oksidaation seurauksena syntyy ensimmäisenä 5-hydroksimetyylisytosiinia, jota seuraavat myöhemmät oksidaatiotuotteet 5-formyylisytosiini ja 5-karboksyylisytosiini. Lopulta DNA:han voidaan korjata tavallinen sytosiiniemäs. Promethion nanopore-sekvenointilaitteemme avulla pystyimme mittaamaan aineistostamme sekä metylaatiota että hydroksimetylaatiota. 

Se, mitä itse asiassa havaitsimme, oli genominlaajuinen hydroksimetylaatiotasojen eikä metylaatiotasojen lasku. Mallinnettuamme demetylaatioprosessin eri vaiheita havaitsimme, että C-vitamiini tehosti erityisesti jälkimmäisten oksidaatiovaiheiden nopeutta mutaation kantajilla. Tästä päättelimme, että C-vitamiini tehostaa TET2:n aktiivisuutta viemällä oksidaatioprosessin kokonaisuudessaan loppuun nopeammin ja että kokoverinäytteistä saadut tuloksemme 12 kuukauden C-vitamiinitutkimuksen jälkeen luultavasti heijastelevat uutta epigeneettistä tasapainotilaa.

Tarinan seuraava luku

Tutkimuksen tekemisessä on kyse totuuden etsimisestä huolellisesti suoritettujen tutkimusten ja kokeiden avulla, mutta myös siitä, että aikaisemmin julkaistuja tutkimuksia tarkastellaan kriittisesti. Meidän tulostemme perusteella C-vitamiinista voisi olla hyötyä hematologisten syöpien ehkäisyssä TET2 mutaatioiden kantajille. Tässä vaiheessa on kuitenkin tärkeää muistaa, että havaintojemme vahvistaminen edellyttää lisätutkimuksia. Vaikka tuloksemme ovatkin lupaavia, ei virallisia suosituksia voida tässä vaiheessa antaa. Odotamme mielenkiinnolla, miten tiedeyhteisö reagoi tutkimukseemme ja toivomme, että työmme on innostanut hematologisten sairauksien tutkimuksen parissa työskenteleviä tutkijoita.

Taira, A., Palin, K., Kuosmanen, A., Välimäki, N., Kuittinen, O., Kuismin, O., … & Aaltonen, L. A. (2023). Vitamin C boosts DNA demethylation in TET2 germline mutation carriers. Clinical Epigenetics, 15(1), 7.

By: Aurora Taira

What a perfect day for baking a pie! You take your recipe book and check the page you have bookmarked. Perhaps you have other favorites that are also bookmarked, while the page with blue cheese flavored mushroom soup is being completely ignored…or even being marked with a red flag!

Every cell in your body is actually using an identical recipe book to make the proteins they need to be the cells they are. This might sound unlikely as the cells in your eye and the cells in your big toe are quite different. The trick is that the cells have bookmarked different pages of the same recipe book; despite the genome being identical in all cells, not every gene is being translated in every cell.

We geneticists call this kind of bookmarking “epigenetic regulation”. DNA methylation is perhaps the most studied mechanism of epigenetic regulation and is often associated with silencing of gene expression. Accurate regulation of epigenetic factors is absolutely vital for normal cells to differentiate, develop and function. 

What happens when the recipe book is not interpreted correctly? – An example of a lymphoma predisposition family.

Reading the recipe book (in this case the genome) of a cell can go wrong in many ways. If cells harbor mutations, the recipe book itself might break. This may cause the cells to make nonfunctional proteins. The wrong pages might be bookmarked resulting in abnormal gene regulation. These changes often predispose cells to malignant degeneration and cancer.

We recently identified a Finnish family with many individuals diagnosed with lymphoma. As they were all from the same family, we reasoned that they probably have an inherited mutation which predisposes these individuals to hematological neoplasia. After mutation analyses we noted that some of the family members were carrying germline heterozygous mutations in a gene called TET2.

The TET2 story

TET2  is an important regulator of DNA demethylation in hematopoietic cells and is often somatically mutated in patients diagnosed with hematological diseases. The family members with mutated TET2 carry only one functional copy of this enzyme, and importantly, showed excess hypermethylation in their genome. The epigenetic regulation has gone wrong: as the amount of functional TET2 is decreased, demethylation is not taking place as normal and methylation keeps accumulating in the wrong places in the genome. So, a mutation in an important epigenetic regulator gene was causing errors in the genome bookmarking, eventually resulting in an increased risk for developing lymphoma.

This family had elderly mutation carriers diagnosed with lymphoma, but also younger unaffected adults carrying the mutation and showing an excess of hypermethylation. Could we do something about the hypermethylation and thus perhaps decrease their risk for developing lymphoma?

Fixing the bookmarks with vitamin C

Translational research and new treatment options are non-existent without basic research. Previous studies on mice and cell lines had found a fascinating feature of our gene of interest: TET2 activity is shown to be boosted by vitamin C. We became inspired by this and asked if vitamin C could also boost the activity of TET2 in humans. Family members from this same lymphoma predisposition family consented to take part in a clinical trial where they took 1g of vitamin C daily for one year. Through blood samples collected before, and at 6 and 12 months of the trial, we analyzed the genome wide methylation and gene expression patterns of these individuals.

Indeed it seemed to work! We saw that vitamin C reinforced the DNA demethylation cascade and reduced the proportion of hypermethylated loci at enhancer regions. The TET2 mutation status was elevating the binding site methylation levels of master hematopoietic transcription factors (such as TBX21 and SPI1) at the beginning of the trial but not after 12 months of vitamin C intake. The number of differentially expressed genes between mutation carriers and controls from the same family decreased after the vitamin C trial.

Spill the beans, cytosine!

Interpretation of the results was not trivial as the demethylation cascade is not as simple as a PhD student would hope it to be. Demethylation can occur either passively during cell division or actively via oxidation by TET2. When TET2 is involved, the first step in the reaction results in 5-hydroxymethylcytosine and in further oxidation steps, 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine are produced. Eventually, unmodified cytosine can be restored. With our nanopore sequencing machine, Promethion, we were able to detect both methylation and hydroxymethylation calls. 

What we actually saw after the trial was a genome wide decrease in hydroxymethylation levels and not methylation levels. With modeling of the reaction rates in the demethylation cascade we saw that vitamin C specifically enhanced the rate of the later oxidation steps and repair rate in the mutation carriers. Thus, we reasoned that vitamin C is boosting TET2 activity by driving the cytosine oxidation cascade to completion at a higher overall rate and that our results from mixed blood cells after 12 months of daily vitamin C likely reflect a new steady state in the system.

Next piece of the puzzle

Research is about searching for the truth through carefully conducted studies and experiments, but it is also about questioning the results previous scientists have published. Our results suggest that vitamin C may be of value in the prevention of hematological neoplasia for individuals carrying TET2 mutations. At this stage it is important to remember that further studies are needed to confirm our findings. While our results are promising, no official recommendations can be established at this point. We look forward to hearing how the scientific community will respond to our study and hope that it has given inspiration to researchers who are puzzling with the prevention of hematological diseases.

Taira, A., Palin, K., Kuosmanen, A., Välimäki, N., Kuittinen, O., Kuismin, O., … & Aaltonen, L. A. (2023). Vitamin C boosts DNA demethylation in TET2 germline mutation carriers. Clinical Epigenetics, 15(1), 7.